水稻斑马叶突变体zebra1349的表型鉴定及基因精细定位

从恢复系育种材料[R128//(R318/R1025)F1]F6中获得一个新的斑马叶突变体zebra1349,突变体秧苗期如果不移栽,与野生型一样表现绿色,移栽后5 d新抽出的叶片包括叶鞘会呈现出与叶脉垂直的黄绿相间的条纹,移栽后30 d抽出的叶片又表现正常绿色,成熟期主要农艺性状与野生型无明显差异。与野生型相比,突变体六叶期斑马叶黄区部位的总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量分别下降了55.86%、61.02%、39.34%和47.03%。透射电镜(TEM)观察表明,突变体斑马叶绿区部位叶绿体发育正常;黄区部位叶肉细胞中叶绿体结构异常,类囊体膜退化和分解严重,类囊体基粒片层数量明显减少,片层间距拉大,排列疏松。对zebra1349与正常叶色品种杂交F1、F2代的遗传分析表明该性状受1对隐性核基因调控。利用1192株zebra1349/02428 F2隐性定位群体,最终把ZEBRA1349基因定位在水稻第12染色体In Del标记indel39和indel44之间,其遗传距离分别为0.04 c M和0.17 c M,根据日本晴基因组序列推测,两标记之间的物理距离约为89 kb。本研究为ZEBRA1349基因的图位克隆和功能研究以及分子标记辅助育种奠定了基础。     

苯丙氨酸解氨酶基因家族在大豆中的时空表达研究

苯丙氨酸代谢途径是植物最重要的次生代谢途径之一,其下游产物包括异黄酮、植保素、木质素等多种次生代谢产物。苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙氨酸代谢途径的起始酶和关键酶。PAL基因家族包含8个基因,为了明晰这8个基因在大豆植株内的表达情况,通过实时定量PCR研究了PAL家族所有成员在大豆植株内的时空表达差异性。发现PAL基因家族总体的相对表达量在生殖生长时期高于营养生长时期,在叶片和子粒中相对表达量较高。PAL1-1、PAL2-1和PAL2-3基因在各部位相对表达量明显高于其他同家族基因,PAL1-1基因各时期稳定表达,PAL2-1和PAL2-3基因在生殖生长后期先后出现表达峰值。这些结果表明大豆PAL基因家族各成员的相对表达量在时间和空间上存在差异,具有一定时空表达特异性。     

转基因阿尔巴斯白绒山羊外源DsRed基因拷贝数与外源基因表达的关系

转基因动物的外源基因通过使用体细胞克隆与胚胎移植的方法将表达载体转入细胞后获得,大多以随机整合的形式存在于受体动物的基因组中,而转基因动物中外源基因的整合拷贝数是影响外源基因表达水平及遗传稳定性的重要因素之一,作为转基因动物遗传稳定性的鉴定指标,获得存活的转基因动物后便有必要对其外源基因拷贝数进行检测.为了研究转基因阿尔巴斯白绒山羊(Capra hircus)基因组内外源海葵红色荧光蛋白(red fluorescence protein from Discosoma sp.,DsRed)基因的拷贝数与其表达量之间是否存在一定的联系,本研究采用较鉴定外源基因拷贝数的传统方法DNA印迹杂交(Southern blot)更为高效率、高灵敏度、高准确性的绝对定量qRT-PCR法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因表达框中3个不同片段的拷贝数.结果表明,外源基因3个片段的拷贝数分别为巨细胞病毒(Cytomealovirus,CMV)启动子:2.80±0.38～13.68±0.16;DsRed基因:1.34±0.04～11.84±0.02;CMV启动子与DsRed连接处:1.58±0.04～19.22±0.38.通过qRT-PCR中相对定量的方法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因mRNA表达量,将其与外源基因中3个不同片段的拷贝数数据分别使用SPSS软件进行相关性分析后,相关性系数P值的结果为:CMV启动子为P=0.763;DsRed基因为P=0.665;CMV启动子与DsRed连接处为P=0.803,3组P值均大于0.05,无显著性相关.上述结果表明,在所检测的6只转基因阿尔巴斯白绒山羊中外源CMV启动子启动的DsRed基因的表达量与其在转基因白绒山羊基因组内的拷贝数在0.05的水平没有显著相关性.另外验证了绝对定量qRT-PCR法在大型转基因家畜的外源基因拷贝数的研究中的可靠性:其重复性良好,误差可控,可以成为检测转基因动物外源基因拷贝数的首选方法.     

草莓果实中BG基因的克隆及功能分析

脱落酸(abscisic acid,ABA)能促进草莓(Fragaria×ananassa)果实的发育成熟,葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BG)能通过水解ABA葡萄糖酯(ABA glucose ester,ABA-GE),把非活性的ABA转换成有活性的ABA,因此,BG参与果实发育进程.但是目前还没有遗传学证据来揭示BG对果实发育的作用机理.为了研究BG在果实发育中的作用,本实验以草莓品种甜查理为试材,通过PCR分子克隆的方法分离到3个编码BG的基因FaBG1、FaBG2和FaBG3;首先对3个基因进行生物信息学、时空表达分析,以及测定果实内源ABA含量的变化;其次通过分子调控FaBG3基因的表达量影响果实内源BG的活性,分析草莓果实的生理指标以及与ABA信号路径、色素代谢和细胞壁代谢相关基因的表达水平.实验结果表明,BG蛋白含有一个BglB区域,是能水解其他的复合物的特异区域.随着草莓果实的发育成熟,ABA的含量逐渐升高,FaBG1基因的表达量一直很低,FaBG2的表达量呈总体的下降趋势,只有FaBG3的表达量与ABA含量变化相一致.利用RNA干扰技术调低草莓果实中FaBG3基因的表达量也下调了FaBG1和FaBG2的表达量,同时降低了果实中BG的活性,导致果实中ABA含量、果实色素和可溶性固形物含量降低,提高了果实的硬度等生理指标,与生理指标相关的如色素代谢基因查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)、类黄酮-3-羟化酶(flavonoid-3-hydroxy-lase,F3H)、类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶(UDP Glc-flavonoid 3-O-glucosyl transferase,UFGT)和二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavo-nol-4-reductase,DFR),果实软化基因果胶甲酯酶(pectin methylesterase,PE)、伸展蛋白(expansin,EXP)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)和果胶酸裂解酶(pectate lyases,PL),果实香味代谢基因醌氧化还原酶(quinone oxidoreductase,QR)、酰基转移酶(alcohol acyltransferase,AT)和ABA信号路径中的基因抗副球菌素蛋白(pyrabatin resistance,PYR)、ABA不敏感体1(ABA insensitive 1,AB11)、ABI3、ABI4和ABI5的表达量等分子指标也出现了不同程度的变化,最后导致了果实延迟成熟.与此相反,FaBG3基因超表达的草莓果实出现了提前着色成熟的现象.果实生理及分子指标的变化可揭示BG调控草莓果实发育进程的机理.     

家蚕杆状病毒bro-d基因缺失对病毒基因转录和细胞凋亡的影响

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)bro (baculovirus repeated ORF)-d基因普遍存在于多种感染鳞翅目昆虫的多角体病毒基因组中,是杆状病毒中一类重复开放阅读框序列.为了解bro-d基因在病毒感染过程中的作用及其与宿主细胞凋亡之间的关系,本研究利用Red重组技术敲除BmNPV基因组中的bro-d基因,构建基因缺失型病毒bro-d-ko-Bacmid,并将该缺失型病毒转染家蚕BmN细胞,利用qRT-PCR技术检测bro-d基因的缺失对病毒基因组复制、转录水平以及抑制凋亡蛋白2基因(inhibitor of apoptosis protein 2,iap2)的影响.结果显示,bro-d基因缺失后会导致病毒基因组的复制水平显著下降(P＜0.05),同时病毒的早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p1O的转录水平也都显著下降(P＜0.05);iap2的转录水平显著下调(P＜0.05).在bro-d基因缺失型病毒的复制水平明显低于野生型病毒的情况下,仍会导致细胞活力显著下降(P＜0.05);bro-d基因缺失引起细胞B淋巴细胞瘤-2(B-celllymphoma-2,Bcl-2)蛋白含量明显低于野生型病毒,而Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein,Bax)含量显著高于野生型病毒(P＜0.05),进而导致细胞凋亡水平上升.结果表明,bro-d基因不仅对病毒各时期基因表达水平具有调控作用,也可通过调控iap2的表达进而调控宿主细胞的凋亡水平.研究成果为深入了解bro-d基因在病毒感染过程中的功能提供了基础资料,也为通过延长宿主细胞寿命、提高目的蛋白表达产量来进行杆状病毒表达载体的改造提供了新思路.     

单性结实与非单性结实樱桃番茄的蔗糖转化酶与相关基因的表达分析

蔗糖代谢,在植物库器官的发育,特别是在坐果及果实发育中发挥着重要作用.蔗糖转化酶(invertase,INV;EC 3.2.1.26)将蔗糖水解为葡萄糖和果糖,是蔗糖代谢的关键酶.分析蔗糖转化酶的酶活性、基因表达模式与单性结实的关系,可为解析蔗糖代谢调控植物坐果的分子机理提供目的基因和理论依据.本研究以单性结实(CP28)和非单性结实(CL26)樱桃番茄(Solanum lycopersicum vat.cerasiforme)为实验材料,对花与果实不同发育时期蔗糖转化酶的酶活性、糖含量和蔗糖转化酶相关基因的表达进行了分析.结果显示,2份番茄材料花蕾期与花期细胞壁蔗糖转化酶(cell wall invertase,CWIN)的活性均高于果实期,且CP28中花蕾期CWIN的活性显著高于CL26 (P＜0.05).对2份番茄材料花蕾期和花期编码CWIN的基因Lin5、Lin6和Lin7以及CWIN抑制因子基因SlINVINH1的qRT-PCR结果显示,Lin6基因在CP28中的表达量是CL26中的93～205倍,达到极显著性差异水平(P＜0.01),而Lin5、Lin7和SlINVINH1基因的表达在2份材料之间无显著性差异.据此推测,番茄CWIN基因Lin6可能是蔗糖转化酶参与调控樱桃番茄果实单性结实的重要功能基因.这一发现为进一步研究CWIN参与调控番茄果实单性结实的分子机理提供了参考.     

松墨天牛寡糖基转移酶亚基STT3B的克隆与表达分析

为阐明松墨天牛寡糖基转移酶亚基STT3B的结构特点和在不同虫态、成虫的不同部位以及幼虫组织中的表达情况,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增c DNA末端(RACE)技术克隆松墨天牛STT3B基因cDNA,命名为MaSTT3B,其Gen Bank登录号为KT362368。序列分析显示其长度为2 552 bp,其中开放阅读框长2 322bp,编码773个氨基酸。MaSTT3B的氨基酸序列与赤拟谷盗相似性最高,为93%,在系统发育树的同一个分支上。用实时荧光定量PCR分析MaSTT3B的相对表达量,结果表明:STT3B在蛹中的表达量高于成虫;在成虫足的表达量最高;在幼虫各组织中,体壁的相对表达量最高。     

不同砧木对黄果柑果实有机酸含量和酸代谢相关酶活性及基因表达的影响

为了探究不同砧木对黄果柑果实有机酸含量、酸代谢相关酶活性及基因表达的影响,为黄果柑砧木的选择提供理论依据。以枳壳、红橘、香橙为砧木,黄果柑实生苗为对照进行研究。黄果柑果实以积累柠檬酸为主,香橙砧能够最有效地降低果实有机酸含量,成熟期比实生苗低24.35%;嫁接能够一定程度的降低CS活性,而对PEPC、MDH活性的影响较小;花后250~330 d,ACO和NADP-IDH活性均表现出香橙砧枳壳砧红橘砧CK的趋势;除实生苗外,黄果柑NADP-IDH表达水平与总酸含量间呈显著性负相关,而CS、MDH、ACO与总酸含量均未表现出显著相关性。香橙是黄果柑理想的砧木品种,砧木间果实有机酸差异是ACO和NADP-IDH活性共同作用的结果,且NADPIDH基因的表达可能是影响不同砧木黄果柑果实中有机酸含量的关键限制因子。     

A-FABP基因表达与拜城油鸡公鸡肌内脂肪的相关性研究

[目的]研究拜城油鸡公鸡A-FABP基因的表达与肌内脂肪含量之间的相关性。[方法]随机选取拜城油鸡公鸡90只,随机分为3组,每组30只。采用索氏抽提法和荧光定量PCR方法分别在12、18和24周龄测定胸肌和腿肌中肌内脂肪含量和A-FABP基因的相对表达量。[结果]随着周龄的增长,肌内脂肪含量显著增加,相同周龄拜城油鸡公鸡腿肌中肌内脂肪含量极显著高于胸肌中肌内脂肪含量(P0.01)。不同周龄间、胸肌和腿肌间A-FABP基因的相对表达量差异不显著(P0.05)。[结论]拜城油鸡公鸡A-FABP基因的表达水平与肌内脂肪含量没有显著相关。     

蛇龙珠等酿酒葡萄品种羧酸酯酶基因片段的SNP分析

[目的]利用单核苷酸多态笥(SNP)分析蛇龙珠等酿酒葡萄的单核苷酸多态性及遗传亲缘关系,为今后研究酿酒葡萄的抗性机制以及培育抗病性葡萄提供参考。[方法]以酿酒葡蛇龙珠8个新株系(E01~E08)、品丽珠、赤霞珠为材料,以欧亚种黑比诺为对照,对羧酸酯酶基因(CXEs)片段进行克隆和序列分析,研究蛇龙珠等酿酒葡萄之间的遗传差异。[结果]序列对比显示,该基因片段在编码区和非编码区均存在不同程度的碱基替换。11份葡萄材料的基因片段共发现87个多态性位点,平均74 bp左右的序列长度上能够检测到一个SNP位点,核苷酸多样度(Pi)0.050 76±0.011 49,单倍型多样度(Hd)1.000±0.039,表现出丰富的遗传多样性。3种中性检验方法比较序列变异模式,结果符合中性生化模型。通过聚类分析可将蛇龙珠E02、E03聚为一类,E07、E08聚为一类,其遗传距离和地理距离一致。该序列片段存在一些突变,这些突变能将蛇龙珠8个新株系与其他酿酒葡萄品种明显区分。[结论]CXEs基因片段的突变位点可作为遗传标记,利用SNP方法可分析葡萄的遗传多样性和亲缘关系。